Pcambia vektorer binära alternativ

Gratis webbhotell, inga annonser eller banners Kan du tänka dig gratis webbhotell som har 99,9 upptid För bra att vara sant Inte mer 000webhost har gjort revolutionen, glöm stereotypen att gratis hosting är opålitligt. Här är beviset: Uppehållsstatistik på 20 servrar. Vi slog din betalade värdleverantör 1500 MB diskutrymme, 100 GB dataöverföring PHP, MySQL, FTP, cPanel .. Vår gratis webbhotell är överladdad med över 60 funktioner, precis som betalt hosting. Obegränsad tillgång till PHP, MySQL, FTP, cPanel, Website Builder och många fler funktioner väntar på dig helt gratis Behöver obegränsad premium hosting som verkligen är obegränsat Inloggning med hosting24 - obegränsat diskutrymme, obegränsad dataöverföring, värd obegränsad domän för bara 3,99 1500 MB diskutrymme, 100 GB dataöverföring Varje konto tar emot 1500 MB utrymme och en jättestort bandbredd på 100 GB, vilket möjliggörs av de obelastade anslutningarna som våra servrar använder. Skulle din webbplats någonsin behöva mer än vårt standardpaket kan erbjuda, erbjuder vi också ett brett utbud av uppgraderingsalternativ. PHP med MySQL Database Support Till skillnad från andra gratis webbhotell hjälper vi PHP och MySQL utan begränsningar. Du får full tillgång till den senaste versionen av PHP och MySQL. Följande PHP-funktioner stöds fullt ut: PHP-post () - funktion och Sendmail Curl, GD2-bibliotek, XML, Zend. htaccess support fopen () och PHP sockets safemode är AV, filuppladdningar är ON Zend Optimizer support, Ioncube Loader. och mycket fler funktioner är aktiverade cPanel Control Panel cPanel är den mest avancerade kontrollpanelen i branschen. Den har massor av funktioner och det är lätt att använda även för nybörjare. Interaktiv hjälp, videohandledning hjälper dig att förstå varför cPanel är det bästa och du kommer aldrig vilja byta till något annat. cPanel används ofta av de betalda värdarna, men vi ger dig det helt gratis Fantastico De Luxe 1-Click Autoinstallerare Slutligen Vi är det första gratis webbhotellföretaget som ger dig tillgång till Fantastico Autoinstaller. Fantastico är ett system som gör det lätt att installera populära scripts. Om du vill förbättra din webbplats med ett diskussionsforum eller ett online-galleri för att visa alla dina senaste semesterklipp, kan du. Med några få musklick kommer din webbplats att omvandlas till en fantastisk resurs för dig, ditt företag eller din familj. Fantastico kan installera över 40 populära skript som: Drupal, Geeklog, Joomla, Xoops, WordPress, b2evolution, Support Logic Helpdesk, phpBB2, SMF, OS Commerce, ViPER Gästbok, Coppermine Photo Gallery, PhpWiki, PHPauction, WebCalendar och mycket mer. För att se hela listan över tillgängliga installationer klicka här. Webbplats Builder Software Vår värd är superladdad med SiteReptile webbplatsbyggare. SiteReptile är det enklaste att använda webbplatsbyggare på marknaden. Bara 3 steg (ange dina inloggningsuppgifter, välj en av 330 högkvalitativa mallar och klicka på publicera) och din webbplats är redo för redigering. Bara ett klick - och du har skapat delsida eller kontaktformulär inlagt. Gratis Webbhotell Premium Webbhotell Webbplats Builder Webbplatsmallar Webbhotell Recensioner Affiliate Program Webbhotell Forum 2007-2015 (c) Copyright First Class Webbhotell. PCambia Vectors Information om våra senaste vektorer, som innehåller GUSPlustrade, kan hittas i BioForge. Medan Cambia inte längre distribuerar dessa vektorer kan du fortfarande begära dem från alla andra laboratorier som använder eller publicerar användningen av dem (de var tillgängliga under en bios-licens med öppen källkod). Mycket av informationen nedan avser äldre pCAMBIA vektorer Växtomvandling är nu rutinmässig hos hundratals laboratorier världen över, med hjälp av bakteriellt medierade eller direkta DNA-överföringsmetoder som bombardemang. Dessa metoder har både tekniska och immateriella egendomsbegränsningar (se BioForge TransBacter Project. Där förbättrade alternativet till Agrobacterium transformation för mer fullständig frihet att driva). En av de största tekniska begränsningarna laboratorier står inför är att många vektorer som används fortfarande är historiska reliker med substandard funktioner som gör DNA-konstruktioner besvärliga eller besvärliga: replikation med låg kopia resulterande i lågavkastande DNA-preps instabila replikoner, vilket orsakar variabel förlust av plasmiden under propagation stor storlek brist på lämpliga restriktionsställen för manipulering begränsat val av selekterbara markörer för både bakterier och växter brist på enkla sätt att konstruera reportergenfusioner. PCAMBIA-vektorkroppen är härledd från pPZP-vektorerna (konstruerad av Hajdukiewicz, Svab amp Maliga, se Referenser ). Även om det inte är perfekt och med tekniska och IP-begränsningar (se BioForge GUSPlus-projektet, där förbättrade reportergener och urvalsmetoder för mer fullständig frihet att fungera), erbjuder pCAMBIA-vektorer: högkopieringsnummer i E. coli för höga DNA-utbyten pVS1 replikon för hög stabilitet i Agrobacterium liten storlek, 7-12 kb beroende på vilka plasmidrestriktionsställen som är utformade för modulära plasmidmodifieringar och små men adekvata poly-bindemedel för att införa ditt DNA av intresse av bakteriell selektion med kloramfenikol eller kanamycinplantsval med hygromycin B eller kanamycin (fosfinotricin urvalet avbröts på begäran av IP-ägaren, Bayer, efter den första distributionen 1997) enkla sätt att konstruera translationella fusioner till gusA-reportergener. Några punkter om pCAMBIA-kloningsstrategin: PUC18-polylinkeren användes i vissa vektorer, men pUC8- och pUC9-polylinkrar användes också för att förenkla valet av kloningsenzym. I PCR-åldern är det inte längre nödvändigt att ha ett stort antal kloningsställen. De mindre polylinkarna eliminerar också potentiella konflikter från platser som Sph I (som har en ATG) eller Xba I (som har en TAG). Detta gör andra ställen i vektorn mer användbara (såsom Sph I-stället utanför den högra T-DNA-gränsen eller Sac II-stället utanför den vänstra T-DNA-gränsen). Plansvalgener i pCAMBIA-vektorerna drivs av en dubbelförstärkare-version av CaMV35S-promotorn och avslutas av CaMV35S-polyA-signalen. NOTERA att denna 35S-promotor kan ha en förstärkande effekt på uttrycket av andra gener i samma kassett, så att genuttryckresultat med användning av pCAMBIA-derivat, i vilka delar av denna promotor fortfarande är närvarande, bör tolkas med försiktighet. Vidare är det ditt ansvar att kontrollera om 35S-promotorn eller andra komponenter du använder är föremål för patent i ditt land. Du hittar hjälp med detta på CAMBIAs patentlins webbplats. Reportergener har en hexa-Histidin-tagg vid C-änden för att möjliggöra enkel rening på immobiliserade metallaffinitetskromatografihartser. Sekvensen för den här taggen sker mellan den första Nhe I-webbplatsen (det finns en andra Nhe I-plats i pVS1-repen som vi inte eliminerade) och den unika Pml I-webbplatsen. Genen av intresse kan införas i stället för reportergenen. Infogning utan stoppkodon och i ram på (första) Nhe I-platsen kommer att addera en hexa-Histidin-tagg till ditt protein av intresse. Infogning utan stoppkodon och i ram på Pml I-webbplatsen kommer att lägga till ett stoppkodon. Infogning på Bst EII-webbplatsen kommer inte att lägga till en tagg eller ett stoppkodon (så du kanske vill se till att en sekvens som sitter här innehåller en stoppkodon). Nomenklaturen för pCAMBIA-vektorer: Det fyrsiffriga numreringssystemet fungerar enligt följande: Första siffran - indikerar växtval: 0 för frånvaro 1 för hygromycinresistens 2 för kanamycin och 3 för fosfinotricin (vektorerna som innehåller fosfinotricinresistensgenen är inte längre tillgängliga från CAMBIA vid begäran från Bayer, som äger patent som begränsar användningen i vissa länder). Andra siffra - indikerar bakterieval: 1 för spektinomycinstreptomycinresistens 2 för kloramfenikol 3 för kanamycin 4 för specstrep och kanamycin. Tredje siffran - indikerar polylinker som användes: 0 för pUC18 polylinker 8 för pUC8 polylinker 9 för pUC9 polylinker. Fjärde siffran - indikerar reportergener som finns: 0 för ingen reportergen 1 för E. coli gusA 2 för mgfp 5 3 för gusA: mgfp 5 fusion 4 för mgfp5: gusA-fusion 5 för Staphylococcus sp. gusA (GUSPlus). Femte siffran - noterar någon annan speciell egenskap. Hittills har detta endast använts med: pCAMBIA1305.1 och plasmider härledda från det där .1 betecknar frånvaron av en signalpeptid från GUSPlustrade-proteinet och pCAMBIA1305.2 där .2 betecknar närvaron av GRP-signalpeptiden för i plantasekretion av GUSPlustrade-proteinet. Lagringsbrev - X indikerar att reportergen saknar sitt eget startkodon och vektorn är för att skapa fusioner till reportern Z indikerar närvaron av en funktionell lacZa för blåvit screening abc indikerar läsramen för fusioner med säkrings - och användningsvektorerna. Viktig notering . På grund av resursbegränsningar har inte alla möjliga vektorfunktionskombinationer skapats på CAMBIA. Du kan initialt vara besviken över att finna att vi inte har till exempel en pCAMBIA2205.2. Vektorerna utformades emellertid så att det borde vara en relativt enkel sak för en forskare som behöver en sådan vektor att konstruera den från komponenterna i andra vektorer. Om du har skapat ett pCAMBIA-vektorderivat som andra forskare kommer att hitta användbara och du vill dela med andra forskare, maila oss. Vector Manual Addendum: Viktigt meddelande till pCAMBIA-användare Denna vektor är en del av en ny serie pCAMBIA GT-BACK-vektorer (genöverförings-bakterieförvärvad kompetens med kanamycinval) som omfattar en modifierad version av pCAMBIA 1105.1 och ett fragment av Ti-plasmiden (härledd från pTiBo542) innehållande endast virA, virB, virC, virD, virE, virG, virK amp virJ operoner. Denna nya enhetliga vektor gör att DNA-överföringsförmågan kan flyttas in och stabiliseras i ett mycket bredare spektrum av bakterier och det kommer att tillhandahållas som en open source toolkit. De nya egenskaperna hos den nya vektorn över Transbacter-tekniken är: tjur Det kan distribueras som fläckar av utspädd DNA på papper (t. ex. på ett brev), vilket eliminerar behovet av att följa importkontrollerna över levande organismer och andra karantänproblem. Detta är det sätt på vilket bokstavligen tusentals laboratorier världen över har erhållit (och vidare skickat ut) pCAMBIA vektorsatser. tjur-GT-BacK-vektor saknar den RK2-härledda oriT som Transbacter bar, vilket eliminerar eller reducerar plasmidens förmåga att konjugeras och överföras till andra värdar genom RK-konjugeringsfunktioner. tjur Det har ett brett värdintervallreplikations ursprung från pVS1 vilket gör att mycket bredare spektrum av bakterier kan undersökas som genöverföringsvektorer, vilket möjliggör val av godartade symbionter som inte förorsakar fysiska eller genetiska påfrestningar på växter. Om du vill diskutera eller fråga några CAMBIA-material vänligen logga in på pCAMBIA0380 pCAMBIA0390 Dessa vektorer innehåller en rad restriktionsställen på båda sidor av pUC8 (0380) eller pUC9 (0390) polylinker, vilket gör dem lämpliga för avancerade byggnadsändamål med användare som sätter in egna promotorer, selektionsgener, reportergener etc. De enda funktionella signalerna mellan T-DNA-gränserna är start - och stoppkodonerna, histidinmarkeringen och NOS-poly (A) - signalen. Alla standardfunktionerna hos pCAMBIA-ryggrad är närvarande: kanamycinbakterieval, högkopieringsnummer i E. coli. och stabil replikering i A. tumefaciens. pCAMBIA1200 pCAMBIA1300 pCAMBIA1380 pCAMBIA1390 pCAMBIA2200 pCAMBIA2300 Forskare som vill ha de senaste versionerna bör se pCAMBIA 1305.1, pCAMBIA1105.1 eller pCAMBIA 1305.2. som kan beställas genom BioForge GUSPlus-projektet. Information om de äldre pCAMBIA-vektorerna är här för enkelhets skyld. Dessa vektorer innehåller minimala heterologa sekvenser för växtomvandling och selektion av transformanter som tillåter införande av önskade gener för transformation till växter men kräver alla promotor - och terminatorsekvenser för växtuttryck av nyligen klonade gener. De minimala selektionsvektorerna har en av två växtvalgener: hpt II-kodningsresistens mot hygromycin eller npt II-kodningsresistens mot kanamycin. I båda fallen drivs valgenen av en dubbelförstärkare-version av CaMV35S-promotorn. Dessa gener har underkastats plats-styrd mutagenes för att eliminera interfererande restriktionsställen inom kodningssekvensen genom tysta förändringar. Två olika bakteriella resistansmarkörer tillhandahålls (kanamycin eller kloramfenikol), vilket möjliggör att ett brett spektrum av Agrobacterium - eller E. coli-stammar används. PUC18-polylinkeren inom lacZa-fragmentet möjliggör bluewhite-screening av kloner i E. coli-kloningsarbete. pCAMBIA1380 och 1390 är baserade på pCAMBIA1300, men pUC18-polylinker-lacZa-fragmentet har raderats och ersatts med de enklare pUC8 (1380) och pUC9 (1390) polylinkrarna, vilka inte innehåller potentiellt störande start - eller stoppkodoner. Det fullständiga modulformatet tillhandahålls för bekväm PCR-kloning och genuttryck. För forskare som utför promotoranalys rekommenderas användningen av den minimala vektorn som innehåller GUSPlus (pCAMBIA 0305.2, som kan beställas genom BioForge GUSPlus-projektet), snarare än någon av de andra pCAMBIA-vektorerna. Co-transformationsstrategier är önskvärda att fysiskt separera i det transformerade växtgenomet promotorn hos växtselektionsgenen (vanligtvis 35S) och promotorn av intresse (ofta mycket svagare eller mer specifik) som driver en gus eller annan reportergen. Det sätt på vilket vi har gjort det i flera år är att två vektorer förvandlas separat till samma stam av Agrobacterium (eller mer föredraget stammar från BioForge TransBacter Project. För frihet att fungera), men uppenbarligen kan samtransformation också göras av samtidigt omvandlas med två separata isolat som var och en innehåller en av vektorerna. Om man använder ett isolat väljs enstaka kolonier, plasmid-DNA analyseras, cellerna induceras på specialmedier (om så krävs för din växtart) och de två cellinjerna blandas omedelbart före applicering på växtvävnaderna som ska transformeras. I våra händer ger denna metod 10-30 transformerade växtledningar som innehåller båda T-DNA. pCAMBIA1201 pCAMBIA1301 pCAMBIA2201 pCAMBIA2301 Forskare som vill ha de senaste versionerna bör se pCAMBIA 1305.1, pCAMBIA1105.1 eller pCAMBIA 1305.2. som kan beställas genom BioForge GUSPlus-projektet. Information om de äldre pCAMBIA-vektorerna är här för enkelhets skyld. Dessa vektorer innehåller en fullständigt funktionell gus A-reporterkonstruktion för enkel och känslig analys av genfunktion eller närvaro i regenererade växter genom GUS-analys. Konstruktionen använder E. coli gusA (N358Q mdash för att undvika N-länkad glykosylering) med en intron (från castor-bönkatalasgenen) inuti kodningssekvensen för att säkerställa att uttrycket av glukuronidasaktivitet härrör från eukaryota celler, inte från uttryck av resterande A. tumefaciens-celler. GusA-reportergenen klonas i nytt modulärt format. Dessa plasmider är lämpliga för införande av andra gener av intresse som innehåller sin egen promotor och terminator. Forskare kan ta bort gusA-genen och infoga sin egen gen av intresse i sin plats eller använda dessa vektorer för att skapa fusioner av gusA med deras gen av intresse (om du har skapat ett pCAMBIA-vektorderivat som andra forskare kommer att hitta användbara och skulle vilja dela det, snälla låt oss veta). Dessa vektorer innehåller pUC18 polylinker-lacZa och samma bakterie - och växtselektionsgener som deras motsvarande minimala vektorer. pCAMBIA1302 pCAMBIA1303 pCAMBIA1304 För de som önskar det bästa av båda världarna i reportergener konstruerade vi dessa vektorer, liknande användbara för GUS Intron Selection Vectors (GIS), men inklusive GFP. Att vara ett icke-katalytiskt protein placerar en inhemsk gräns för detekteringskänslighet med fluorescerande proteiner och dyra utrustning behövs för kvantitativa analyser och mikroskopisk observation. GFP är ändå populär som en reportergen och vi ger den klonad i helt nytt modulärt format för dem som vill använda det. Dessa vektorer är baserade på pCAMBIA1301 (bakteriell kanamycinresistens, planthygromycinselektion, pUC18 polylinker i lacZa) men innehåller mgfp 5-versionen av Aequoria victoria grönt fluorescerande protein (Siemering et al., 1996) antingen ensam - pCAMBIA1302 - eller i translationell fusion med gusA (N358Q) i båda arrangemangen: pCAMBIA1303 har en gusA-mgfp5-His6-fusion och pCAMBIA1304 har en mgfp5-gus A-His6-fusion. Dessa är intronfria versioner av gusA (N358Q), så det finns möjlighet att uttryck i primära transformanter är resultatet av uttryck av reporterproteinerna med återstående Agrobacterium tumefaciens-celler eller andra bakterier närvarande i växtodlingar. Analys av stort antal transformanter av ris och Arabidopsis vid CAMBIA visade att fluorescensen producerad av MGFP5-proteinet var ganska svag. Som ett resultat av detta konstruerade våra forskare liknande konstruktioner med hjälp av egfp-genen som var tillgänglig från Clontech. Resultaten med dessa proteiner var överlägset överlägsen, och även om vi inte kan distribuera vektorer som innehåller denna gen rekommenderar vi att forskare köper pEGFP från Clontech och använder detta för att konstruera egna plasmider som är analoga med pCAMBIA1302, pCAMBIA1303 eller pCAMBIA1304. pCAMBIA1381 och 1391 och deras Xa, b, c ORF-varianter som är konstruerade för att utnyttja gus A som en sann reporter av genuttryck genom fusionskonstruktion härledas dessa vektorer från pCAMBIA1380 och 1390 och innehåller en promotorfri icke-intron gus A (N358Q) genen (utan ett initieringskodon) i tre läsramar, och med antingen pUC8 eller pUC9-orienterade polylinkrar. Detta medger enkel konstruktion av karboxi-terminala proteinfusioner till gusA. Urvalet är med hygromycin och bakterieval med kanamycin. PCAMBIA1381- och 1391-vektorerna kan också användas för konstruktion av transkriptionella eller translationella fusioner till gus A. De liknar Xa, b, c-serien, fastän de behåller initieringskodonet av Nco I-stället i den nya modulära strukturen runt gus A (N358Q) genen, och är endast tillgängliga i en läsram. pCAMBIA1281Z pCAMBIA1291Z pCAMBIA1381Z pCAMBIA1391Z Designad för promotortestning i planta. dessa vektorer har en promotorfri version av gus A (N358Q) med katalasintronet omedelbart nedströms en trunkerad lacZa innehållande antingen pUC8 eller pUC9 polylinker. Alla plasmider i denna serie har hygromycin som växtselekteringsgenen, och bakterieval är tillgängligt med antingen kloramfenikol (1281Z, 1291Z) eller kanamycin (1381Z, 1391Z). Den stympade lacZa är funktionell för bluewhite screening av kloner i lämpliga E. coli värdstammar. Erfarenheten av dessa vektorer har visat att den mycket starka 35S-promotorn (i själva verket en dubbelförstärkareversion av den) som driver hptII-genen i T-DNA hos dessa och de flesta andra pCAMBIA orsakar signifikant störning i de observerade expressionsmönstren. Tolka dina resultat med försiktighet Negativa kontrolltransformanter skapade med hjälp av en av dessa vektorer utan en promotor tillsatt uppströms om gusA-genen visar låg till måttlig nivå GUS-uttryck i ett antal vävnader. Förstärknings-fällningsexperiment utförda vid CAMBIA med användning av något omarrangerade versioner av dessa vektorer har också visat konsekvent interfererande uttryck som vi attribut till den närliggande 35S-promotorn. Detta artefaktuella uttryck kan förvärras i experiment där forskare försöker analysera trimmade versioner av deras promotorer av intresse som saknar de naturliga isolerande sekvenserna av fulllängdspromotorer. För att undvika denna 35S-interferens från promotoranalyser rekommenderar vi att använda samtransformationsstrategier som beskrivs ovan i avsnittet om minimala vektorer. I en sådan strategi kan promotorn av intresse klonas i en av våra Promoter-Cloner-vektorer, men detta bör först modifieras genom att utföra en dubbel-förstärkning av Xmn I-ekvivalent, gelrening av det stora (8,9 kb) ryggradsfragmentet och själv - ligation. En sådan vektor kan kallas pCAMBIA0381Z, men vi har aldrig konstruerat den för distribution som en del av pCAMBIA-vektorsatsen. Genotyper av några användbara Agrobacterium tumefaciens-stammar Varning. Agrobacterium användning är begränsad i jurisdiktioner som USA, och det kan vara oklokt att använda det i någon forskning som kan leda till en produkt till salu eller import till USA. Du kanske vill använda Transbacter-systemet i stället för frihet att använda. För information, se BioForge TransBacter Project. LBA4404 (Ach5 pTiAch5) SmSp (R) i virulensplasmiden (från Tn904) eliminerades allt T-DNA från pTiAch5 i pAL4404 (Hoekema et al., 1983). EHA101, genotyp C58 pTiBo542 T-region :: aph, Km (R) A281-derivat som hyser pEHA101, T-DNA ersatt med nptII, eliminering av T-DNA-gränser obehandlade, supervirulenta (Hood et al 1986). EHA105 är ett Km (S) - derivat av EHA101 (Hood et al., 1993). AGL1, genotyp är AGL0 (C58 pTiBo542) recA :: bla, T-region raderad Mop () Cb (R) AGL0 är en EHA101 med T-regionen raderad, vilken också raderar aph-genen (Lazo et al., 1991). A281, rekonstruerad stam, derivat av A136 (härdad C58) som hyser pTiBo542, supervirulent (Hood et al., 1986). Ach5. agrocinopin, oktopintyp B6S3, A6. oktopintyp Bo542. leucinopin, succinamopin, agropintyp, svagare än A281 C58, T37. nopalintyper A281. succinamopin, leucinopin, agrocinopin Antibiotika Kloramfenikol, 100 mikrogmL för stam AGL1, 10 mikrogmL för LBA4404, 25 mikrogmL för EHA105 och för E. coli. Kanamycin, 50 mikrogmL för både Agrobacterium och E. coli. För val av transformerade risväxter använder vi hygromycin vid 50 mikrogmL och 25 mikrogmL för tobak. Chen L, Zhang S, Beachy RN, Fauquet CM (1998) Ett protokoll för konsekvent storskalig produktion av friska transgena risplantor. Plant Cell Reports 18: 25-31 Christou P (1991) Produktion av transgena ris (Oryza sativa L.) växter från agronomiskt viktiga indica och japonica sorter via elektrisk urladdning partikelacceleration av exogent DNA till omogna zygotiska embryon. Bioteknik 9: 957-962 Christou P (1997) Risomvandling: bombardemang. Växt Mol Biol 35: 197-203. Deblaere R, Reynaerts A, Hofte H, Hernalsteens JP, Leemans J och Van Montagu M (1987) Vektorer för kloning i växtceller. Meth Enzymol 153: 277-292 Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P. (1994) Den lilla mångsidiga pPZP-familjen av Agrobacterium-binära vektorer för växtomvandling. Plant Mol Biol 25: 989-994 Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Effektiv omvandling av ris (Oryza sativa L.) medierad av Agrobacterium och sekvensanalys av gränserna för T-DNA. Plant J 6: 271-282 Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA (1983) Binär vektorstrategi baserad på separation av vir - och T-regionen hos Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmiden. Nature 303: 179-180 Hood EE, Helmer GL, Fraley RT, Chilton MD (1986) Hypervirulensen av Agrobacterium tumefaciens A281 kodas i en region av pTiBo542 utanför T-DNA. J Bac 168: 1291-1301 Hood EE, Gelvin SB, Melchers S, Hoekema A (1993) Nya Agrobacterium-hjälparplasmider för genöverföring till växter (EHA105). Trans Res 2: 208-218 Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987) GUS-fusioner: Beta-glukuronidas som en känslig och mångsidig genfusionsmarkör i högre växter. EMBO J 6: 3901-3907 Klapwijk PM, van Breukelen J, Korevaar K, Ooms G, Schilperoort RA (1980) Tansättning av Tn904 som kodar streptomycinresistens i oktopin Ti-plasmiden av Agrobacterium tumefaciens. J Bac 141: 129-136 Lazo GR, Stein PA, Ludwig RA (1991) Ett DNA-transformationskompetent Ara bidopsis genomiskt bibliotek i Agrobacterium. BioTechnology 9: 963-967 Ohta S, Mita S, Hattori T, Nakamura K (1990) Konstruktion och uttryck i tobak av en beta-glukuronidas (GUS) reportergen innehållande en intron inom den kodande sekvensen. Plant Cell Physiol 31: 805-814 Ooms G, Hooykaas PJJ, Van Veen RJM, Van Beelen P, Regensburg-Tunk JG, Schilperoort RA (1982) Octopin Ti-plasmid deletionsmutanter av Agrobacterium tumefaciens med betoning på höger sida av T - område. Plasmid 7: 15-29 Peralta EG, Hellmiss R, Ream W (1986) Overdrive, en T-DNA-överföringsförstärkare på A. tumefaciens-tumörinducerande plasmiden. EMBO J 5: 1137-1142 Porath, J. (1992). Immobiliserad metalljonaffinitetskromatografi. Protein Expre Purif 3: 263-281 Siemering KR, Golbik R, Sever R, Haseloff J (1996) Mutationer som undertrycker termosensibiliteten hos grönt fluorescerande protein. Curr Biol 6: 1653-1663 Tanaka A, Mita S, Ohta S, Kyozuka J, Shimamoto K, Nakamura K (1990) Förbättring av främmande genuttryck av en dikotintron i ris men inte i tobak är korrelerad med en ökad nivå av mRNA och en effektiv splicing av intronen. Nucl Acids Res 18: 6767-6770 Övriga resurser Om du vill diskutera eller fråga några CAMBIA-material, vänligen maila oss på materialscambia. org Läs vanliga frågor om att be om CAMBIA-material Läs vanliga frågor om pCAMBIA-vektorer GUSPlus-information i BioForge GUSPlus-projektet. Institutionen för växtpatologi och odlingsfysiologi, Louisiana State University och LSU AgCenter, Baton Rouge, USA. Copyright kopia 2013 Norimoto Murai. Detta är en öppen åtkomstartikel som distribueras under Creative Commons Attribution-licens, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i något medium, förutsatt att det ursprungliga arbetet är korrekt citerat. Mottaget 7 mars 2013 reviderad 4 april. 2013 godkänd 13 april. 2013 Nyckelord: Agrobacterium tumefaciens Binära vektorer pRK2 pRi pSA pVS1 T-DNA Ti-plasmid Denna översikt kränker utvecklingen av växtens binära vektorer av Ti-plasmiden i Agrobacterium tumefaciens under de senaste 30 åren. En binär vektorstrategi designades 1983 för att separera T-DNA-regionen i en liten plasmid från virulensgenen i avirulent T-DNA-mindre Ti-plasmid. De små växtvektorerna med T-DNA-regionen har nu helt enkelt kallats binära Ti-vektorer. En binär Ti-vektor består av ett brett värdområde-replikon för fortplantning i A. tumeraciens, en antibiotikaresistensgen för bakteriell selektion och T-DNA-regionen som skulle överföras till växtgenomet via bakterievirulensmaskinen. T-DNA-regionen avgränsad av de högra och vänstra gränssekvenserna innehåller en antibiotikaresistensgen för växtval, reportergen och eller några genen av intresse. ColEI-replikonet tillsattes också till plasmidkedjan för att öka propagationen i Escherichia coli. En allmän trend i den binära vektorns utveckling har varit att öka plasmidstabiliteten under en lång samodlingsperiod av A. tumefaciens med målvärdesväxtvävnaderna. En andra trend är att förstå molekylmekanismen för bred värdintervallreplikation och att använda den för att reducera plasmidens storlek för att underlätta kloning och för högre plasmidutbyte i E. coli. Det breda värdintervallet replikon av VS1 visade sig vara ett val av replikon över de för pRK2, pRi och pSA på grund av överlägsen stabilitet och av små, väldefinierade replikon. Nyutvecklade växt binära vektorer pLSU har den lilla storleken av plasmidkedjan (4566 bp) bestående av VS1 replikon (2654 bp), ColE1 replikon (715 bp), en bakteriell kanamycin (999 bp) eller tetracyklinresistensgen och T-DNA region (152 bp). Agrobacterium tumefaciens är en gramnegativ jordbakterie och växtpatogen som orsakar krongallsjukdom hos angiospermer och gymnospermer 1. Agrobacterium-plant interaktion var ett av de första modellsystemen där molekylmekanismen för växtpatogenitet har belysats i detaljer 2,3. Omkring 20 kbp segment av DNA (T-DNA) i en tumörinducerande plasmid (cirka 200 kbp Ti-plasmid) överförs från bakterien till värdplangenomet genom ett molekylärt maskineri som nära liknar en bakteriell konjugal överföring 4-6. Sjukdomsfenotypen är en manifestation av uttryck av bakteriella T-DNA-gener i växtceller som är överproduktion av två växttillväxthormoner, cytokinin och auxin. Detta naturliga DNA-överföringssystem har utnyttjats för att introducera gener av agronomiskt intresse i växter som resulterade i produktion av genetiskt modifierade grödor av bioteknologiska campanjer. Inledande tillvägagångssätt för genöverföring var att introducera en målgen i T-DNA-regionen av Ti-plasmiden efter antingen en enkel - (samintegration) eller dubbel-homolog rekombination mellan en mellanliggande vektor (pRK290) och Ti-plasmiden 7,8. En binär växtvektorstrategi utformades för att separera T-DNA-regionen i en liten plasmid från virulensgenen i avirulent T-DNA-mindre Ti-plasmid 9. De små växtvektorerna med T-DNA-regionen har nu helt enkelt kallats binära Ti vektorerna 10, 11. 2. Reproduktionstyp för brett värdintervall från pRK2 av IncP-1 Incompatibility Group Nästan alla binära vektorer använde ett replikationsstart för pRK2 vid början av dess tillämpning (Tabell 1). pRK2 är en stor 56 kbp plasmid av inkompatibilitetsgrupp P-1 tabell 1. Översikt över binära Ti-vektorer som är listade baserat på de breda värdintervallreplikonerna som används för propagering i Agrobacterium tumefaciens andor Escherichia coli. Anmärkning: 1: ColEI-replikon härlett från pBR322 eller pUC18 tillsattes för att befrämja förökning av binära Ti-vektorer i E. coli 2: Mobilisering (Mob) av binära vektorer assisterad av pRK2013 från E. coli till A. tumfacience möjligt (Ja) eller ej möjligt (nr) genom triparental parning 3: Bakteriell selektion med antibiotika: kloramfenikol (chl), kanamycin (kan), gentamycin (gen), spektinomycin (spc), streptomycin (str) eller tetracyklin (tet). Neomycin PhosphoTransferase (NPTI) - genen ger kanamycinresistensen i bakterier 4: Ursprungen av T-DNA-gränssekvenser härledda från antingen nopalin (nop) eller oktopin (okt) typ Ti-plasmider, nopalintyp Ti-plasmid-konsensusgräns-sekvens (cons) 5: Planta-uttryckbara selekteringsmarkörgener, en promotor eller terminatorsekvens som härrör från nopalinsyntasgen (nop), oktopinsyntetasgen (okt), manopinsyntasgen (mas), blomkålsmosaikvirus 35S (35S) eller tumörmorfologi Large (tml) T - DNA-genen. Bialafosresistens (BAR) - genen bekräftar herbicidens glufosinatresistens. Gentamycin Acetyl Transferase (aacC1) - gen ger gentamycinresistensen i växter. Hygromycin PhosphoTransferase (HPT) kodande regioner överför hygromycinresistensen i växter. Neomycin PhosphoTransferase (NPTII) kodande regioner ger kanamycinresistensen i växter. Platsen för växtmarkeringsmarkörgenen proximalt till antingen Left Border (LB) eller Right Border sequences (RB) indikerades. ursprungligen isolerad från Klebsiella aerogenes 12. En användbar egenskap hos P-1 replikon är ett omfattande värdintervall bland gramnegativa bakterier. pRK2 replikeras och bibehålls i Esherichia coli, A. tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas aeruginosa och andra arter. Smaller derivatives of pRK2 were generated such as 20.0 kbp pRK290, 11.0 kbp pTJS133, 10.3 kbp pRK252, and 7.0 kbp pTJS75 13. Replication of pRK2 derivatives requires 700 bp oriV and trfA region, and stable maintenance of these plasmids requires additional regions depending on species. For Agrobacterium, stable maintenance of plasmid in a non-selective condition after 35 generations declined progressively from pRK2 (100) to pTJS133 (96), pRK290 (89), pTJS75 (57) and pRK252 (12). The smallest pRK2 derivative pTJS75 has oriV, trfA, oriT and tetracycline resistance. The most stable derivative pTJS133 in Agrobacterium was generated by addition of 3.1 kb region containing korA and korB to pTJS75. A separate plasmid pRK2013 contains the pRK2 transfer genes, its own mobilization genes and ColE1 replicon, and is used by tri-parental mating to transfer pRK2 plasmids from E. coli to A. tumefaciens. Thus, the major limitation of pRK2-derived plasmids to be used for the binary vectors are the large multi-loci required for replication and maintenance of plasmids (11.0 kbp pTJS133). Another limitation is that the smaller pRK2-derived plasmids (10.3 kbp pRK252, 7.0 kbp pTJS75 and 5.0 kbp mini-pRK2 replicon vector) have been maintained less stably in Agrobacterium in non-selective conditions 14,15. 2.1. pRK252-Based Binary Vectors A smaller pRK2 derivative 10.3 kbp pRK252 was the backbone of a first binary vectors pBin19 (11.8 kbp) with addition of Streptoccocus faecalis NPTIII gene for bacterial kanamycin resistance, nopaline pTiT37 T-DNA borders, a plant selection marker nos:NPTII:nos, the - complementary region of - galactosidase (lacZ locus) for selection, and polylinker site from M13mp19 16. pBI121 (14.7 kbp) and other pBI constructs, and pBIG pBIB were based on pBin19 with addition of a new GUS reporter gene 35S:GUS:nos 17,18. pAGS127 (15.0 kbp) has a pRK252 backbone with the T-DNA region consisting of octopine pTiA6 right border and octopine pTiAch5 left border, a plant selection marker nos:NPTII:ocs, the lac Z locus and polylinker, and cos site for a large DNA fragment insertion 19. 2.2. pRK290-Based Binary Vectors pRK290 was the first pRK2-derived plasmid developed for a shuttle vector between E. coli and S. meliloti to study the genetic loci for nodulation and nitrogen fixation of the nitrogen-fixing bacteria 12. pRK290 was also used as an intermediate vector to transfer a plant gene for the bean seed storage protein phaseolin to TDNA of pTi15955 and then introduce the gene for expression in the genomes of sunflower and tobacco 8,20. A binary vector pOCA18 (24.3 kbp) has the pRK290 backbone and the T-DNA region of octopine pTi right and left borders, a plant selection marker nos:NPTII:ocs, and cos site for insertion of DNA library of Arabidopsis thaliana 21. Similarly, pJJ1881 (25.7 kbp) has the pRK290 backbone with octopine pTiA6 right border and pTiAch5 left borders, a plant selection marker nos: NPTII:ocs gene, polylinker, 35S:GUS or SPT:nos (SPT, Streptomycin PhosphoTransferase), or maize transposons Ac or Ds 22. The pRK290-based pJJ1881 vector derivative was shown to stably maintain DNA fragments over 300 kbp in E. coli 23,24. 2,3. pTJS75-Based Binary Vectors The plasmid pTJS75 was the smallest derivative (7.0 kbp) of pRK2 and used to generate binary vectors pGA471 (15.6 kb) 25,26 and pTRA409 (11.5 kbp) 27. The vector pGA471 has nopaline pTiT37 right and left borders, a plant selection marker gene nos:NPTII:nos, cos site and ColE1 replicon in T-DNA. The vector pTRA409 has the T-DNA with octopine pTi15955 right (with overdrive) and left borders, a plant selection marker gene tml:NPTII:tml and used to test promoter deletion mutants of the bean seed storage protein phaseolin gene. 2.4. mini-pRK2 Replicon-Based Binary Vectors The binary vector pPCV001 (9.2 kbp) has a conditional mini-RK2 replicon (oriV and oriT) and can be maintained in Agrobacterium and E. coli only when co-existed in trans with the trf and tra loci in a helper plasmid pRK2013 or in the E. coli chromosome 14. The T-DNA region of pPCV001 has nopaline pTiC58 right border and octopine pTiB6S3 left border, a plant selection marker gene nos:NPTII:ocs, and pBR322 sequence for plasmid rescue experiments 28,29. The binary vector pCB301 (5.0 kbp) was constructed by PCR cloning of a mini-pRK replicon (oriV and trfA) and bacterial NPTIII kanamycin resistance gene based on DNA sequence of pBin19 15. The T-DNA region consists of nopaline pTiT37 right and left borders, nos:BAR:nos plant selection marker gene (Bar, herbicide glufosinate) and pBlueScriptII polylinker for cloning. 3. Agrobacterium rhizogenes pRi Origin of Replication Agrobacterium rhizogenes is a soil-living plant pathogen causing hairy root disease. A large 200 kbp plasmid pRi has the T-DNA and virulence region and is responsible for causing the disease phenotype. The origin of replication of pRi plasmid locates within the 8.1 kb BanHI-11 fragment and can stably coexist with the pTi origin of replication in A. tumefaciens. The binary vector pC22 (17.5 kb) has the origin of replication of pRiHR1 and ColE1, bacterial resistance gene for ampicilincarbenicillin or streptomycinspectinomycin 30. The T-DNA region of pC22 consists of the right and left borders from octopine pTiB6S3, a plant selection marker gene nos: NPTII:nos, multi-cloning site (BamHI, XbaI) and the cos site for in vitro packaging of Arabidopsis thaliana genomic library. A second binary vector pCGN1547 (14.4 kb) also uses the origin of replication of pRiRH1 and ColE1 and a bacterial resistance gene for gentamycin 31. The T-DNA region of the vector has the right and left borders of octopine pTiA6, a plant selection marker mas:NPTII: mas, the lacZ locus and polylinker site from pUC18 for clonig. The stability of binary vectors in Agrobacterium was compared between plasmids with the origin of replication from pRi and pRK2, pCGN1547 and pBin19, respectively. pCGN1547 was much more stable than pBin19 and after 27 generations in non-selective conditions 54 of Agrobacterium lost the pBin19 while only 1 lost pCGN1547. Thus, the binary vectors containing the pRi origin of replication has the major advantage in stable maintenance, and a limitation in a low copy number of one or few in cells of Agrobacterium. 4. Broad Host-Range Origin of Replication from pSa of IncR Incompatability Group Wide-host-range origin of replication from pSa derived from a cryptic mini-plasmid P15A in E. coli. The replication locus of pSa ori and rep region is one of the smallest known naturally occurring replicons (2.3 kbp). The replication regions were split into two separate plasmids as two-component binary vector systems to reduce the size of T-DNA-containing plasmids 32. pGreen0029 (4.6 kbp) contains a bacterial kanamycin resistance gene, pSa origin of replication, and the TDNA with nopalinepTiT37 right (with overdrive) and left borders, and a plant selection marker nos:NPTII:nos. The suplementary plasmid pSoup (9.3 kbp) has a bacterial tetracycline resistance gene and pSa rep region. pSoup must co-exist in Agrobacterium for replication of pGreen. This two-component binary vector system was used to construct LucTrap vectors to generate transcriptional and translational fusion of the firefly luciferase reporter to randomly targetted genes 33. The stability of binary vectors in Agrobacterium was compared between plasmids with the origin of replication from pSa and pRK2, pGreen000 and pBin19, respectively. pGreen000 was less stable than pBin19 and after one-day in non-selective conditions 50 of Agrobacterium lost the pGreen000 plasmid. Thus, the stable maintenance of pSa-repiconcontaining binary vectors in Agrobacterium is the major limitation for its use when required for a long co-cultivation period of over two days. A new version of the two-component binary vector system, pCLEAN-G and pCLEAN-S corresponds to pGreen and pSoup, respectively 34. A new feature is that both plasmids have the T-DNA region delimited by nopaline pTi consensus right and left borders. The T-DNA of pCLEAN-G115 (6.0 kbp) has a plant selection marker gene 35S:HPT:nos, lacZ selection and polylinker. Supplementary pCLEAN-S166 (11.1 kbp) has a different selection marker nos:HPT:nos in T-DNA (HPT, Hygromycin Phospho Transferase). 5. Broad Host-Range Origin of Replication from pVS1 of IncP Incompatability Group pVS1 is a non-conjugative 29 kbp plasmid of IncP incompatibility group isolated from Psuedomonas aeruginosa. The plasmid was found to replicate in a wide-range of gram-negative bacteria including other Pseudomonas species (P. syringae, P. putida) as well as in A. tumefaciens and S. leguminosarun, but not in E. coli 35. A pVS1 derivative pME290 contains a 3.7 kbp region for replication and stability gene 36. Another pVS1 derivative pGV910 contains an 8 kbp fragment for the stability, replication and mobilization gene 37. The stability of pGV910 in A. tumefaciens GV3101 was compared with that of pRK2 replicon-containing pRK290 37. pGV910 was much more stable than pRK290 and after 15 generations in non-selective conditions only less than 0.5 lost pGV910 while 26 of Agrobacterium lost the pRK290. Plasmid pVS1 was found compatible with IncP-1 and IncP-4 replicons. Coexistence of pGV910 and pRK290 appeared to increase the stability of pRK290 and after 16 generations in nonselective conditions only 12 of Agrobacterium lost pRK290. The origin of replication of pVS1 was defined to a 3.1 kbp fragment for staA, ORF3, repA and oriV by sequence analysis, mutagenesis and maintenance assay in P. fluorescens 38. The coding region of StaA (209 codons) contains two ATP-binding sites and motifs typical of a partitioning protein and is essential for segregational stability. The ORF3 (71 codons) has no apparent similarity with other known proteins but deletion and mutational studies showed the ORF3 is important for segregational stability. The RepA protein with 357 codons shares a strong similarity with other RepA proteins. Mutation from Ala 246 to Val 246 increased the plasmid copy number from 5.9 to 13.8 copies per chromosome, mutation from Asp 260 to Asn 260 reduce the copy number. The oriV locus has the typical sequence organization of origin of replication, a DnaA box, four direct repeats of 21 bp each, an AT-rich region, and a second DnaA box. The backbone of binary Ti vector pPZP plasmid is the 3.8 kb fragment of pVS1 origin of replication and the 1.1 kb ColE1 replicon and bom site from pBR322 39. pPZP111 (11.8 kb) has the T-DNA region consisting of nopaline pTiT37 right and left borders, a plant kanamycin or gentamycin resistance gene 35S:NPTII or aacC1: 35S, respectively, lacZ selection and polylinker from pUC18. pPZP111 has a bacterial chloramphenicol resistance gene from pBR325, and pPZP211 (11.9 kb) has a bacterial streptomycinspectinomycin resistance aadA gene, encoding aminoglycoside-3-adenyltransferase. Presently, a series of pCAMBIA plasmids (9.0 kbp) are among the most widely utilized binary Ti vectors (Genbank accession numbers AF234290-AF234316). The plasmids have the same backbone of pPZP plasmids and their sizes are either 6.2 or 6.4 kb with a bacterial kanamycin or chloramphenicol resistance genes, respectively. The T-DNA region is delimited by the nopaline pTiT37 right (with overdrive) and left border sequences. Two types of plant selection marker are available as either the kanamycin or hygromycin resistance gene, 35S: NPTII or HPT:35S, respectively. Two - glucuronisase reporters are provided, GUS from E. coli (gusA Eco ) or GUSPlus from Staphylococcus sp. (gusA Ssp ). A second reporter green fluorescent protein is also available either as by itself (gfp) or fusion genes with GUS (gusA Eco :gfp or gfp:gusA Eco ). The lacZ selection with multi-cloning sites for insertion was derived from either pUC18, 8 or 9. Modular binary Ti vectors pMODUL and pSAT were developed based on pZP200 (6.7 kbp) as a backbone of the vectors 40,41. The pMODUL vectors took advantage of use of low frequency-occurring enzymes, 13 hexanucleotide and 6 ocatanucleotide restriction sites, and 5 homing endonuclease sites to construct six different expression units in a single construct. Modular pSAT vectors also used 6 octanucleotide restriction endonucleases and Gateway recombination cloning sites for modular assembly of Nand C-terminal fusions to five different autofluorescent tags enhanced green (EGFP), yellow (EYFP) and cyan fluorescent proteins ECFP), red autofluorescent protein (DsRed2), and reduced chloride-ionand pH-sensitivity yellow fluorescent protein (CitrineYFP). Most recently, a series of smaller high-yielding binary Ti vectors pLSU were constructed to increase the cloning efficiency and plasmid yield in E. coli and A. tumefaciens 42-44. The size of the binary vector backbone pLSU1 was reduced to 4566 bp with ColE1 replicon (715 bp) for E. coli and VS1 replicon (2654 bp) for A. tumefaciens, a bacterial kanamycin resistance gene (999 bp), and the T-DNA region (152 bp) ( Figure 1 ). The binary Ti vectors with the truncated VS1 replicon were stably maintained with more than 98 efficiency in A. tumefaciens without antibiotic selection for four days of successive transfers. The transcriptional direction of VS1 replicon can be the same as that of ColE1 replicon (co-directional transcription), or opposite (head-on transcription) as in the case of widely used vectors (pPZP or pCambia). The new pLSU vectors with co-directional transcription yielded in E. coli up to four-fold higher transformation frequency than those with the head-on transcription. In A. tumefaciens the effect of co-directional transcription is still positive in up to 1.8-fold higher transformation frequency than that of head-on transcription. Transformation frequencies of new vectors are over six-fold higher than those of pCambia vector in A. tumefaciens. DNA yields of new vectors were three to five-fold greater than pCambia in E. coli. Figure 2 illustrates the composition of T-DNA in pLSU1 to 5. pLSU1 is a basic backbone vector with the twelve common restriction sites in TDNA. pLSU2 and 3 have the kanamycin resistance NPTII gene as a plant-selectable marker. pLSU4 and 5 contain the hygromycin resistance HPH gene as a plant - Figure 1. Schematic presentation of backbone structure of binary Ti vector pLSU1 (4566 bp). T-DNA is at the top of figure delimited by the right (RB) and left border (LB) with 12 common restriction endonuclease sites, EcoRV (EV), SphI (Sp), HindIII (HIII), NcoI (Nc), XhoI (Xh), KpnI (K), EcoRI (EI), BamHI (BH), PstI (P), ScaI (Sc, XbaI (Xb), and SacI (Sa). The backbone plasmid include the Neomycin PhosphoTransferase I (NPTI), ColE1 origin of replication (ColE1), Stability region A (StaA), Replication region A (RepA), and VS1 origin of replication (VS1). Figure 2. Schematic presentation of the T-DNA region of binary Ti vectors pLSU1 to 5. pLSU1 is a basic backbone vector with the twelve common restriction sites in T-DNA. pLSU2 and 3 have the Neomycin PhosphoTransferase II gene (NPTII) adjacent to the left border as a plant selection marker for kanamycin resistance. pLSU4 and 5 contain the Hygromycin B Phosphotransferasae gene (HPH) adjacent to the left border as a plant selection marker for hygromycin resistance. pLSU3 and 5 also include the - glucuronidase reporter gene (GUS) in addition to the plant selection marker in the T-DNA. selection marker. pLSU3 and 5 also have the GUS reporter gene in addition to the plant-selectable marker. To be compatible with the Gateway Technology (Invitrogene), pLSU vectors were modified to include a bacterial tetracycline-resistance gene 42. The size of the tetracycline resistance gene TetC from pBR322 was reduced to 1468 bp containing 1191 bp of the coding region, 93 bp of 5 upstream, and 184 bp 3-downstream region. The final size of basic binary vector backbone pLSU11 is 5034 bp. pLSU12 and13 have the kanamycin resistance NPTII gene as a plant selection marker. pLSU14 and 15 contain the hygromycin resistance HPH gene as a plant-selectable marker. pLSU13 and 15 also have the - glucuronidase (GUS) reporter gene in addition to the plant selection marker. Constructed also was a mobilizable version of tetracycline-based binary Ti vector pLSU16 in which the mob function of ColE1 replicon was maintained for mobilization of the binary vector from E. coli to A. tumefaciens by tri-parental mating. The final size of binary Ti vector backbone pLSU16 is 5580 bp. The author wishes to acknowledge the financial support partly from the Department of Plant Pathology and Crop Physiology, the College of Agriculture, Louisiana State University, and from the Louisiana Agriculture Experiment Station, LSU AgCenter. E. F. Smith and C. O. Towsend, A Plant Tumor of Bacterial Origin, Science, Vol. 25, No. 643, 1907, pp. 671- 673. doi:10.1126science.25.643.671 I. Zaenen, N. Van Larebeke, H. Teuchy, M. Van Montagu and J. Schell, Supercoiled Circular DNA in Crown-Gall Inducing Agrobacterium Strains, Journal Molecular Biology, Vol. 86, No. 1, 1974, pp. 117-127. doi:10.1016S0022-2836(74)80011-2 M. D. Chilton, M. H. Drummond, D. J. Merlo, D. Sciaky, A. L. Montoya, M. P. Gordon and E. W. Nester, Stable Incorporation of Plasmid DNA into Higher Plant Cells: The Molecular Basis of Crown Gall Tumorigenesis, Cell, Vol. 11, No. 2, 1977, pp. 263-271. doi:10.10160092-8674(77)90043-5 J. R. Zupan and P. Zambryski, Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the Plant Cell, Plant Physiology, Vol, 107, No. 4, 1995, pp. 1041-1047. doi:10.1104pp.107.4.1041 J. Sheng and V. Citovsky, Agrobacterium-Plant Cell DNA Transport: Have Virulence Proteins, Will Travel, Plant Cell, Vol. 8, No. 10, 1996, pp. 1699-1710. S. B. Gelvin, Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: The Biology behind the Gene-Jockeying Tool, Microbiology Molecular Biology Reviews, Vol. 67, No. 1, 2003, pp. 16-37. P. Zambryski, H. Joos, C. Genetello, J. Leemans, M. Van Montagu and J. Schell, Ti Plasmid Vector for the Introduction of DNA into Plant Cells without Alteration of Their Normal Regeneration Capacity, EMBO Journal, Vol. 2, No. 12, 1983, pp. 2143-2150. N. Murai, D. W. Sutton, M. G. Murray, J. L. Slightom, D. J. Merlo, N. A. Reichert, C. Sengupta-Gopalan, C. A. Stock, R. F. Baker, J. D. Kemp and T. C. Hall, Phaseolin Gene from Bean Is Expressed after Transfer to Sunflower via Tumor-Inducing Plasmid Vectors, Science, Vol. 222, No. 4623, 1983, pp. 476-482. A. Hoekema, P. R. Hirsch, P. J. J. Hooykas and R. A. Schilperoort, A Binary Plant Vector Strategy Based on Separation of Virand T-Region of the Agrobacterium tumefaciens Ti Plasmid, Nature, Vol. 303, 1983, pp. 179-180. doi:10.1038303179a0 R. Hellens, P. Mullineaux and H. Klee, A Guide to Agrobacterium Binary Ti Vectors, Trends in Plant Science, Vol. 5, No. 10, 2000, pp. 446-448. T. Komori, T. Imayama, N. Kato, Y. Ishida, Y. Ueki and T. Komari, Current Status of Binary Vectors and Superbinary Vectors, Plant Physiology, Vol. 145, No. 4, 2007, pp. 1155-1160. G. Ditta, S. Stanfield, D. Corbin and D. R. Helinski, Broad Host Range DNA Cloning System for GramNegative Bacteria: Construction of a Gene Bank of Rhizobium meliloti, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 77, No. 12, 1980, pp. 7347-7351. doi:10.1073pnas.77.12.7347 T. J. Schmidhauser and D. R. Helinski, Regions of Broad-Host-Range Plasmids RK2 Involved in Replication and Stable Maintenance in Nine Species of Gram-Negative Bacteria, Journal of Bacteriology, Vol. 164, No. 1, 1985, pp. 446-455. C. Koncz and J. Schell, The Promoter of TL-DNA Gene 5 Controls the Tissue-Specific Expression of Chimeric Genes Carried by a Novel Type of Agrobacterium Binary Vector, Molecular General Genetics, Vol. 204, No. 3, 1986, pp. 383-396. doi:10.1007BF00331014 C. Xiang, P. Han, I. Lutziger, K. Wang and D. J. Oliver, A Mini Binary Vector Series for Plant Transformation, Plant Molecular Biology, Vol. 40, No. 4, 1999, pp. 711- 717. doi:10.1023A:1006201910593 M. Bevan, Binary Agrobacterium Vectors for Plant Transformation, Nucleic Acids Research, Vol. 12, No. 22, 1984, pp. 8711-8721. doi:10.1093nar12.22.8711 R. A. Jefferson, Assaying Chimeric Genes in Plants: The GUS Gene Fusion System, Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 5, No. 4, 1987, pp. 387-405. doi:10.1007BF02667740 D. Becker, Binary Vectors Which Allow the Exchange of Plant Selectable Markers and Reporter Genes, Nucleic Acid Research, Vol. 18, No. 1, 1990, p. 203. doi:10.1093nar18.1.203 P. Van den Elzen, K. Y. Lee, J. Townsend and J. Bedbrook, Simple Binary Vectors for DNA Transfer to Plant Cells, Plant Molecular Biology, Vol. 5, No. 3, 1985, pp. 149-154. doi:10.1007BF00015678 C. Sengupta-Gopalan, N. A. Reichert, R. F. Baker, T. C. Hall and J. D. Kemp, Developmentally Regulated Expression of the - Phaseolin Gene in Tobacco Seed, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 82, No. 10, 1985, pp. 3320-3324. doi:10.1073pnas.82.10.3320 N. E. Olszewski, F. B. Martin and F. M. Ausubel, Specialized Binary Vector for Plant Transformation Expression of the Arabidopsis thaliana AHAS Gene in Nicotiana tabacum, Nucleic Acids Research, Vol. 16, No. 22, 1988, pp. 10765-10782. doi:10.1093nar16.22.10765 J. D. G. Jones, L. Shlumukov, F. Carland, J. English, S. R. Scofield, G. J. Bishop and K. Harrison, Effective Vectors for Transformation, Expression of Heterologous Genes, and Assaying Transposon Excision in Transgenic Plants, Transgenic Research, Vol. 1, No. 6, 1992, pp. 285-297. doi:10.1007BF02525170 A. F. Bent, B. N. Kunkel, D. Dahlbeck, K. L. Brown, R. Schmidt, J. Giraudat, J. Leung and B. J. Staskawicz, RPS2 of Arabidopsis thaliana: A Leucine-Rich Repeat Class of Plant Disease Resistance Genes, Science, Vol. 265, No. 5180, 1994, pp. 1856-1860. doi:10.1126science.8091210 Q. Tao and H.-B. Zhang, Cloning and Stable Maintenance of DNA Fragments over 300 kb in Escherichia coli with Conventional Plasmid-Base Vectors, Nucleic Acid Research, Vol. 26, No. 21, 1998, pp. 4901-4909. doi:10.1093nar26.21.4901 G. An, B. D. Watson, S. Stachel, M. P. Gordon and E. W. Nester, New Cloning Vehicles for Transformation of Higher Plants, EMBO Journal, Vol. 4, No. 2, 1985, pp. 277-284. G. An, High Efficiency Transformation of Cultured Tobacco Cells, Plant Physiology, Vol. 79, No. 2, 1985, pp. 568-570. doi:10.1104pp.79.2.568 M. D. Burow, P. Sen, C. A. Chlan and N. Murai, Developmental Control of the - Phaseolin Gene Requires Positive, Negative, and Temporal Seed-Specific Transcriptional Regulatory Elements and Negative Element for Stem and Root Expression, Plant Journal, Vol. 2, No. 4, 1992, pp. 537-548. doi:10.1111j.1365-313X.1992.00537.x C. Koncz, N. Martini, R. Mayerhofer, Z. Koncz-Kalma, H. Korber, G. Redei and J. Schell, High-Frequency TDNA-Mediated Gene Tagging in Plants, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, No. 21, 1989, pp. 8467-8471. doi:10.1073pnas.86.21.8467 B. Reiss, C. Koncz, I. Moore and J. Schell, A Family of Binary Gene Vectors with Low Inter-Transformant Variation, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.), Vol. 13, 1994, pp. 143-149. C. Simoens, T. Alliotte, R. Mendel, S. Muller, J. Schiemann, M. van Lijsebettens, J. Schell, M. van Montagu and D. Inze, A Binary Vector for Transferring Genomic Libraries to Plants, Nucleic Acids Research, Vol. 14, No. 20, 1986, pp. 8073-8090. doi:10.1093nar14.20.8073 K. E. McBride and K. D. Summerfelt, Improved Binary Vectors for Agrobacterium-Mediated Plant Transformation, Plant Molecular Biology, Vol. 14, No. 2, 1990, pp. 269-276. doi:10.1007BF00018567 R. P. Hellens, E. Z. Edwards, N. R. Leyland, S. Bean and P. M. Mullineaux, pGreen: A Versatile and Flexible Binary Ti Vectors for Agrobacterium-Mediated Plant Transformation, Plant Molecular Biology, Vol. 42, No. 6, 2000, pp. 819-831. doi:10.1023A:1006496308160 L. I. A. Calderon-Villalobos, C. Kuhnle, H. Li, M. Rosso, B. Weisshaar and C. Schwechheimer, LucTrap Vectors Are Tools to General Luciferase Fusions for the Quantification to Transcript and Protein Abundance in Vivo, Plant Physiology, Vol. 141, No. 1, 2006, pp. 3-14. doi:10.1104pp.106.078097 V. Thole, B. Worland, J. W. Snape and P. Vain, The pCLEAN Dual Binary Vector System for Agrobacterium-Mediated Plant Transformation, Plant Physiology, Vol. 145, No. 4, 2007, pp. 1211-1219. doi:10.1104pp.107.108563 Y. Itoh, J. M. Watson, D. Haas and T. Leisinger, Genetic and Molecular Characterization of the Pseudomonas Plasmid pVS1, Plasmid, Vol. 11, No. 3, 1984, pp. 206-220. doi:10.10160147-619X(84)90027-1 Y. Itoh and D. Haas, Cloning Vectors Derived from the Pseudomonas Plasmid pVS1, Gene, Vol. 36, No. 1-2, 1985, pp. 27-36. doi:10.10160378-1119(85)90066-6 G. Van den Eede, R. Deblaere, K. Goethals, M. Van Montagu and M. Holsters, Broad Host Range and Promoter Selection Vectors for Bacteria That Interact with Plants, Molecular Plant-Microbe Interactions, Vol. 5, No. 3, 1992, pp. 228-234. doi:10.1094MPMI-5-228 S. Heeb, Y. Itoh, T. Nishijyo, U. Schnider, C. Keel, J. Wade, U. Walsh, F. OGara and D. Haas, Small, Stable Shuttle Vectors Based on the Minimal pVS1 Replicon for Use in Gram-Negative, Plant-Associated Bacteria, Molecular Plant-Microbe Interactions, Vol. 13, No. 2, 2000, pp. 232-237. doi:10.1094MPMI.2000.13.2.232 P. Hajdukiewicz, Z. Svab and P. Maliga, The Small, Versatile pPZP Family of Agrobacterium Binary Vectors for Plant Transformation, Plant Molecular Biology, Vol. 25, No. 6, 1994, pp. 989-994. doi:10.1007BF00014672 I. J. W. M. Goderis, M. F. C. De Bolle, I. E. J. A. Francois, P. F. J. Wouters, W. F. Broekaert and B. P. A. Cammue, A Set of Modular Plant Transformation Vectors Allowing Flexible Insertion of up to Six Expression Units, Plant Molecular Biology, Vol. 50, No. 1, 2002, pp. 17-27. doi:10.1023A:1016052416053 T. Tzfira, G. W. Tian, B. Lacroix, S. Vyas, J. Li, Y. Leitner-Dagan, A. Krichevsky, T. Taylor, A. Vainstein and V. Citovsky, pSAT Vectors: A Modular Series of Plasmids for Autofluorescent Protein Tagging and Expression of Multiple Genes in Plants, Plant Molecular Biology, Vol. 57, No. 4, 2005, pp. 503-516. doi:10.1007s11103-005-0340-5 S. Lee, New Binary Ti Vectors with Co-Directional Replicons for Agrobacteium tumefaciens-Mediated Transformation of Higher Plants, Ph. D. Thesis, Louisiana State University, Baton Rouge, 2011. S. Lee, G. Su, E. Lasserre, M. A. Aghazadeh and N. Murai, Smaller High-Yielding Binary Ti Vectors pLSU with Co-Directional Replicons for Agrobacterum tumefaciens-Mediated Transformation of Higher Plants, Plant Science, Vol. 187, 2012, pp. 49-58. G. Su, S. Park, S. Lee and N. Murai, Low Co-Cultivation Temperature at 20730C Resulted in the Reproducible Maximum Increase in Both the Fresh Weight Yield and Stable Expression of GUS Activity after Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Tobacco Leaf Disks, American Journal of Plant Sciences, Vol. 3, No. 4, 2012, pp. 537-545. Journal Menu gtgt